Metaboli sekunder dari Nephrolepis radicans

METABOLIT SEKUNDER

DARI TUMBUHAN PAKU Nephrolepis radicans (Burm.) Kuhn

Suyatno, Rina Liyaningsih, dan Nisfatul Khasanah

Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya

Jl. Ketintang Surabaya (60231), Tilp. 031-8298761

e-mail: suyatno_kimunesa@yahoo.com

ABSTRAK

Penelitian ini ditujukan untuk menentukan struktur molekul senyawa metabolit sekunder dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan  paku Nephrolepis radicans dan menguji aktivitas pendahuluannya sebagai antioksidan. Dalam penelitian ini ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi, pemisahan dilakukan dengan metode kromatografi (kromatografi cair vakum), pemurnian dengan metode rekristalisasi, uji kualitatif dengan pereaksi Liebermann-Burchard, FeCl₃ dan Shinoda test, sedangkan penentuan struktur molekul dengan metode spektroskopi (UV, IR, dan MS). Dari hasil penelitian diperoleh suatu campuran steroid (kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol) berupa kristal tak berwarna dengan titik leleh 123-125 ^oC serta isolat flavonoid pinostrobin (5-hidroksi-7-metoksi flavanon) berupa kristal tak berwarna putih dengan titik leleh 95-96 ^oC. Pinostrobin menunjukkan aktivitas antioksidan berdasarkan hasil uji KLT autografi menggunakan larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).

Kata-kata  kunci: Nephrolepis radicans, ekstrak n-heksana, flavonoid, steroid, b-sitosterol, kampesterol, stigmasterol, pinostrobin, antioksidan

ABSTRACT

The aims of research are to determine the molecular stucture of the secondary metabolites isolated from  the n-hexane extract of  the Nephrolepis radicans’s stem and to assay their prior activity as antioxidant. Extraction, separation, and purification were  conducted by maceration, chromatography (vacuum liquid chromatography), and recrystalization, respectively. Qualitative tests were carried out using the Liebermann-Burchard reagent, FeCl₃, and Shinoda test, while the molecular structure of isolates were identified by spectroscopic methods  (UV, IR, MS). Based on the reseach, it were obtained the steroid mixture (campesterol, stigmasterol, and b-sitosterol) as the colorless crystall, m.p. 123-125 ^oC, and a flavonoid pinostrobin (5-hydroxy-7-methoxy flavanone) as the colorless crystall, m.p. 95-96 ^oC. Pinostrobin showed antioxidant activity based on the TLC autography using 1,1-diphenil-2-picrylhydrazyl (DPPH).

Key words: Nephrolepis radicans, n-hexane extract, flavonoid, steroid, b-sitosterol, campesterol, stigmasterol, pinostrobin, antioxydant

Pendahuluan

Tumbuhan paku Nephrolepis radicans (Burm.) Kuhn merupakan salah satu tumbuhan paku famili Polypodiaceae serta telah menjadi salah satu kekayaan alam hayati Indonesia (Piggot, 1988). Tumbuhan paku ini tumbuh di daerah yang bersuhu sedang (± 25-30 ^oC), di tempat-tempat yang kelembabannya tinggi terutama pada musim hujan, sering dijumpai pada tumpukan batu-bata yang lama tidak digunakan, tanah-tanah yang lembab, di semak belukar, di tanah yang mengandung limbah, dan di kawasan tepi sungai (Hovenkamp & Miyamoto, 2005).

Dari beberapa spesies tumbuhan paku dengan genus Nephrolepis pernah dilaporkan manfaatnya sebagai bahan obat cacing, kanker perut,  serta dapat digunakan sebagai sayuran. Dari dari tumbuhan paku genus tersebut telah dilaporkan keberadaan senyawa saponin, kardenolin, flavonoid, dan tanin (Anonim, 2010). Namun demikian pemanfaatan tumbuhan paku Nephrolepis radicans sebagai obat tradisional serta kandungan kimiawinya belum pernah dilaporkan.

Dalam makalah ini akan dilaporkan keberadaan senyawa steroid dan flavonoid dari ekstrak n-heksana bagian batang tumbuhan paku Neprolepis radicans serta uji pendahuluannya sebagai antioksidan.

Metode

Alat yang Digunakan

Peralatan yang digunakan meliputi Fisher John melting point apparatus, spektrofotometer UV (Shimadzu Pharmaspec UV-1700), spektrofotometer IR (Buck Scientific-500),  spektrometer massa (Shimadzu QP-5000 menggunakan ion mode EIMS, lampu UV (Desaga Heidelberg), seperangkat alat kromatografi cair vakum, kromatografi lapis tipis, serta peralatan gelas yang umum digunakan pada penelitian kimia organik bahan alam.

Bahan yang Digunakan

            Bahan yang digunakan meliputi bahan tanaman yang berupa serbuk kering tumbuhan paku Nephrolepis radicans  yang dikumpulkan dari desa Karangtalun, kecamatan Kalidawir, kabupaten Tulungangung, Jawa Timur dan diidentifikasi di LIPI Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur. Bahan kimia yang digunakan berupa n-heksana p.a. dan teknis, kloroform p.a., etil asetat p.a. dan teknis, metanol p.a,  etanol p.a., kieselgel 60 GF-254 (Merck), pelat silika gel 60 F-254 (Merck), asam klorida p.a., natrium hidroksida p.a., aluminium klorida p.a.,  natrium asetat p.a., asam borat p.a., larutan FeCl₃ 5%, dan pita Mg.

.

Isolasi  dan Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder

Sejumlah serbuk batang (978 g) bagian batang Nephrolepis radicans   dimaserasi dengan pelarut n-heksana (4 x 24 jam). Ekstrak n-heksana yang diperoleh diuapkan secara vakum menggunakan rotavapor menghasilkan ekstrak padat berwarna hijau gelap (5,27 g). Selanjutnya sebanyak 4,5 g ekstrak dipisahkan dengan cara kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fasa diam kieselgel Merck 60 GF-254 dan eluen berturut-turut n-heksana, campuran n-heksana-etil asetat, dan etil asetat menghasilkan 124 fraksi (@ 15 mL). Hasil pemisahan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis menggunakan eluen n-heksana-etil asetat = 4 : 1.

Gabungan fraksi 16-28 sebanyak 399 mg direkristalisasi berulang-ulang menggunakan pelarut metanol menghasilkan isolat A sebanyak 11 mg. Sementara itu fraksi gabungan 34-40 sebanyak 494 mg direkristalisasi berulang-ulang menggunakan pelarut metanol menghasilkan isolat B  sejumlah 199 mg. Isolat yang diperoleh diuji kemurniannya dengan menentukan titik leleh dan KLT menggunakan 3 sistem eluen. Identifikasi struktur molekul dilakukan dengan metode spektroskopi UV, IR, dan MS.

Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan dengan Uji  Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Autografi

Isolat yang diperoleh diuji potensi pendahuluannya sebagai antioksidan menggunakan uji KLT autografi. Isolat sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 1 ml pelarut yang cocok, kemudian  ditotolkan pada pelat KLT silikagel 60 F-254 menggunakan pipa kapiler. Setelah dikeringkan, pelat disemprot dengan larutan DPPH 0,004% dalam metanol. Hasil uji dinyatakan positif sebagai antioksidan jika diperoleh bercak kuning berlatar ungu pada  kromatogram (Ervina, dkk., 2002).

Hasil dan Pembahasan

Hasil-Hasil Penelitian

1. Hasil isolasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans

 Telah diuraikan sebelumnya bahwa dari hasil pemisahan 4,5 g ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans  menggunakan kromatografi cair vakum dihasilkan fraksi sebanyak 124 dengan volume masing-masing 15 mL.

Berdasarkan hasil monitoring dengan KLT, fraksi 16-28 (399 mg) digabung dan  direkristalisasi menggunakan pelarut metanol menghasilkan isolat A (11 mg). Isolat tersebut diperoleh berupa kristal putih kebiruan dengan titik leleh 95-96 ^oC.  Isolat menunjukkan hasil positif dengan FeCl₃ (ungu) dan tes Shinoda (Mg-HCl) (kuning). Kromatografi lapis tipis menggunakan tiga sistem eluen terhadap senyawa hasil isolasi menunjukkan satu noda dengan harga Rf = 0,75 (n-heksana-etil asetat = 9 : 1), Rf = 0,83 (n-heksana-etil asetat = 4 : 1), dan Rf = 0,94 (kloroform) serta satu puncak pada kromatografi gas pada Rt = 22,4 menit. Dengan demikian isolat telah memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Spektrum ultraviolet isolat A dalam pelarut metanol menunjukkan puncak-puncak serapan  pada l _maks (log  e)  : 289 (7,17),  332 (bh) (6,44) nm; (MeOH + NaOH): 290 (7,34), 350 (bh) (7,19) nm; (MeOH+AlCl₃): 309 (7,26), 372 (bh) (6,54) nm; (MeOH+AlCl₃+HCl): 309 (7,23), 375 (bh) (6,54) nm; (MeOH+NaOAc): 290 (7,44), 339 (bh) (6,33) nm; (MeOH+NaOAc+H₃BO₃): 292 (7,11), 339 (bh) (6,37) nm. Spektrum IR isolat A yang dipreparasi dengan teknik pellet KBr memberikan pita-pita serapan pada daerah _maks  : 3433 (OH),  3040 (C-H aromatik), 2924 (vibrasi ulur C-H alkil),1645 (C=O terkelasi), 1569 (C=C aromatik), 1383 (vibrasi tekuk C-H alkil), 1298, 1086 (C-O) cm-1. Spektrum massa isolat A yang diukur dengan  teknik EIMS memberikan puncak-puncak pada  m/z (int.rel., %): 270 (M⁺) (93), 242 (5), 227 (6), 223 (1), 193 (100) (puncak dasar),168 (20), 166 (65), 150 (5),  138 (74), 123 (12), 110 (35), 95 (68), 77 (33), 69 (30), 51 (28), 39 (18).

Sementara itu fraksi gabungan 34-40 (494 mg) direkristalisasi menggunakan pelarut metanol menghasilkan isolat B (199 mg). Isolat tersebut diperoleh berupa kristal tak berwarna dengan titik leleh 123-125 ^oC. Isolat menunjukkan hasil positif dengan pereaksi Liebermann-Burchard (biru). Uji kromatografi lapis tipis menggunakan tiga sistem eluen terhadap senyawa hasil isolasi menunjukkan satu noda dengan harga Rf = 0,56 (n-heksana-etil asetat = 4 : 1), Rf = 0,13 (n-heksana-kloroform = 1 : 1), dan Rf = 0,38 (kloroform). Namun kromatogram hasil kromatografi gas menunjukkan 3 puncak dengan pada Rt masing-masing 29,3; 29,8 dan 30,6 menit. Dengan demikian isolat masih belum murni atau merupakan campuran senyawa. Spektrum ultraviolet isolat B dalam pelarut n-heksana menunjukkan puncak serapan utama pada l _maks (log  e)  = 221 (3,06) nm.  Spektrum IR isolat B yang menunjukkan pita-pita serapan pada daerah _maks  : 3380 (OH),  2934 dan 2862 (vibrasi ulur C-H alkil), 1653 (C=C), 1460 dan 1363 (vibrasi tekuk C-H alkil), 1049 (C-O) cm-1. Spektrum massa isolat A yang diukur dengan  teknik EIMS memberikan 3 puncak (B-1, B-2, dan B-3).  Spektrum massa isolat B-1 menunjukkan puncak-puncak pada  m/z (int.rel., %): 400 (M⁺) (27), 382 (19), 367 (15), 315 (23), 289 (19), 255 (15), 231 (15), 213 (27), 43 (100). Isolat B-2 menunjukkan puncak-puncak pada m/z (int.rel., %): 412 (M⁺) (11), 397 (4), 370 (4), 327 (4),  288 (15), 271 (8), 257 (4),  229 (31), 201 (4), 135 (23), 124 (100), 43 (58).  Sementara itu isolat B-3 menunjukkan puncak-puncak pada m/z (int.rel., %): 414 (M⁺) (76), 396 (23), 381 (19), 329 (73), 273 (15), 255 (23), 231 (19),  213 (31), 43 (100).

 2.  Hasil uji aktivitas pendahuluan antioksidan senyawa hasil isolasi.

Berdasarkan hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan dengan KLT autografi, terbukti bahwa isolat A positif memiliki aktivitas antioksidan, sementara isolat B menunjukkan hasil negatif. Dengan demikian isolat A memiliki potensi sebagai bahan antioksidan alami.

Pembahasan Hasil Penelitian

1. Penentuan struktur molekul isolat A

Dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans telah ditemukan suatu senyawa hasil isolasi berupa kristal berwarna putih kebiruan dengan titik leleh 95-96 ^oC. Hasil positif pada uji dengan tes Shinoda (kuning) dan pereaksi FeCl₃ (ungu) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk golongan flavonoid. Munculnya dua puncak masing-masing pada l_maks 289 nm (pita II) dan 332 nm (pita I) (bh) dalam spektrum UV mengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa flavonoid jenis flavanon (Markham, 1988). Pita serapan pada 3433 (OH), 3040 (C-H aromatik), 1645 (C=O terkelasi), 1569 (C=C aromatik)  cm^-1  dalam spektrum IR mendukung bahwa senyawa hasil isolasi termasuk golongan flavonoid. Tidak adanya pergeseran batokromik pita II pada penambahan pereaksi NaOH dan NaOAc menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi tidak memiliki gugus OH bebas pada posisi C-7. Pergeseran batokromik pita II (20 nm) pada penambahan pereaksi AlCl₃ + HCl menunjukkan keberadaan gugus OH bebas pada posisi C-5. Tidak adanya pergeseran batokromik pita II pada penambahan pereaksi NaOAc + H₃BO₃ menunjukkan tidak adanya gugus orto-dihidroksi pada cincin A. 

Spektrum massa (EIMS) senyawa hasil isolasi menunjukkan ion molekul pada m/z 270 yang sesuai untuk rumus  molekul pinostrobin, C₁₆H₁₄O₄ (DBE = 10). Pola fragmentasi yang ditunjukkan dalam spektrum massa mendukung bahwa isolat merupakan pinostrobin. Puncak ion fragmen pada m/z 193 (M-77) yang sangat tinggi intensitas relatifnya (100%) serta m/z 77 mendukung tidak adanya substituen pada cincin B (Bick, et al., 1972). Sementara itu puncak ion fragmen pada m/z 166 (M-104) mendukung tidak adanya gugus hidroksil pada C-3 dalam isolat flavonoid pinostrobin. Berdasarkan data spektroskopi di atas serta perbandingan  dengan data literatur maka dapat disimpulkan bahwa isolat A merupakan senyawa flavonoid 5-hidroksi-7-metoksi flavanon (pinostrobin).

Penemuan flavonoid pinostrobin merupakan yang pertama kalinya dalam tumbuhan paku Nephrolepis radicans serta dalam tumbuhan paku genus Nephrolepis. Namun demikian senyawa tersebut telah banyak ditemukan pada divisi tumbuhan berbiji (spermatophyta), misalnya Boensenbergia rotunda (kencur), Eucalyptus sieberi (Birck, et al., 1972), Alpinia rafflesiana (Mohamad, et al., 2004), dan Pinus armandii (Fang, et al., 1989).

2. Penentuan struktur molekul isolat B

Selain isolat A, dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans juga telah berhasil diisolasi isolat B berupa kristal tak berwarna dengan titik leleh 123-125 ^oC. Hasil positif (warna biru) pada uji dengan pereaksi Liebermann-Burchard menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk golongan steroid. Puncak serapan pada l_maks 221 nm dihasilkan oleh transisi elektron p ® p* dalam ikatan rangkap dua C=C yang tidak terkonjugasi. Pita serapan yang tajam dari vibrasi ulur C-H alkil pada 2934 cm^-1 dan 2862 cm^-1 dalam spektrum IR, memperkuat keberadaan kerangka hidrokarbon steroid dalam isolat B. Keberadaan gugus OH yang ditunjukkan pita serapan IR pada 3380 cm^-1 mengindikasikan isolat B merupakan steroid alkohol (sterol). Hal tersebut diperkuat dengan hasil positif dalam uji Liebermann-Burchard (biru). Berdasarkan analisis dengan kromatografi gas-spektroskopi massa (GCMS), isolat B ternyata bukan merupakan senyawa tunggal, melainkan campuran dari 3 senyawa yang masing-masing memiliki massa molekul relatif 400 (B-1), 412 (B-2), dan 414 (B-3). Berdasarkan perbandingan pola fragmentasi spektrum massa senyawa B-1, B-2, dan B-3 dengan data dalam library GCMS Jurusan Kimia FMIPA Universitas Gadjahmada serta data literatur, diduga ketiga senyawa steroid tersebut masing-masing adalah kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol. Ketiga fitosteroid tersebut sering ditemukan dalam tumbuhan paku (Suyatno, et al., 2007; Kurniawati & Suyatno, 2010). Menurut Rao & Koratkar (1997), ketiga fitosteroid tersebut secara in vivo mampu menurunkan kadar kolesterol darah (hipokolesteremik), kolesterol LDL dan lemak darah (hipolipidemik), mengurangi resiko kanker kolon, efektif mengatasi pembesaran prostat (antiinflamasi), antibakteri, antifungal, antiatherogenik, dan antiulseratif.

 

3. Kajian terhadap aktivitas pendahuluan antioksidan senyawa flavonoid hasil isolasi

Berdasarkan hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan dengan KLT autografi menunjukkan bahwa isolat pinostrobin memiliki potensi sebagai bahan antioksidan karena menunjukkan noda berwarna kuning berlatar ungu. Aktivitas antioksidan tersebut disebabkan oleh keberadaan gugus OH fenolik pada C-5 yang mudah teroksidasi membentuk quinon jika bereaksi dengan suatu radikal bebas. Sifat pinostrobin tersebut sangat diperlukan dalam upaya melindungi lipoprotein dalam membran sel dari kerusakan akibat reaksi oksidasi dengan radikal bebas. Sifat kepolaran yang tidak terlalu tinggi dari pinostrobin sangat mendukung aktivitas antiperoksidasi lipid pada membran sel yang bersifat relatif non polar.

Mengingat bahwa radikal bebas merupakan salah satu pemicu terbentuknya sel kanker maka aktivitas antiperoksidasi lipid piostrobin juga mendukung potensi senyawa tersebut sebagai antikanker. Smolarz, et al. (2006) telah melaporkan bahwa flavonoid pinostrobin menunjukkan aktivitas antikanker terhadap leukemia sel line HL-60. Larutan 1 mM pinostrobin  mampu menyebabkan apoptosis sel sebesar 70-88%. Disamping itu juga dilaporkan oleh Sukardiman bahwa pinostrobin dalam temu kunci sangat ampuh untuk melawan sel kanker, karena senyawa tersebut bersifat antioksidan, mampu menyebabkan apoptosis sel kanker, serta menghambat kerja enzim DNA topoisomerase I (Sukardiman, 2010). Dengan demikian isolat flavonoid pinostrobin tersebut memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai bahan antioksidan dan antikanker.

Simpulan

  Berdasarkan hasil-hasil penelitian yang telah dibahas pada bagian sebelumnya  dapat disimpulkan bahwa dari batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans telah berhasil dipisahkan suatu senyawa flavonoid golongan flavanon  yaitu 5-hidroksi-7-metoksi flavanon (pinostrobin) serta campuran steroid kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol. Isolat flavonoid pinostrobin memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai bahan antioksidan.

Ucapan Terimakasih

Ucapan terimakasih disampaikan kepada saudara Wardaya dari LIPI Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur  yang telah membantu dalam mengidentifikasi sampel tumbuhan.

Daftar Pustaka

Anonim. (2009). Tumbuhan paku. http://blogger-bioika.blogspot.com. Diakses pada tanggal 2 Desember 2010.

Bick, I.R.C., Brown, R.B., Hillis, W.E. (1972). Three flavanones from leaves of Eucalyptus sieberi. Aust. J. Chem. 25. 449-451.

Ervina, M, Soediro, I.S., Kusmardiyani, S. (2002). Akar lobak (Raphanus sativus L. var Hotensis back.) sebagai Penangkap Radikal Bebas. Jurnal Obat Bahan Alam. 1 [1] 7-15.

Hovenkamp, P. H. & Miyamoto, F. (2005). A Conspectus of the Native and Naturalized  Species of Nephrolepis (Nephrolepidaceae) in the World. Blumea. 50. 279-322.

Kurniawati I & Suyatno. (2010). Senyawa Steroid dari Ekstrak Etil Asetat Daun Tumbuhan Paku Angiopteris evecta (G.Forst) Hoffm. Prosiding Seminar Nasional Kimia. Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya. Tanggal 20 Pebruari 2010.

Markham, K.R. (1988). Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Penerjemah Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB.

Mohamad, H., Abas, F., Permana, D., Lajis, N.H., Alib, A.M., Sukaric, M.A., Hinc, T.Y.Y., Kikuzakid, H., Nakatani, N. (2004). DPPH Free Radical Scavenger Components from the Fruits of Alpinia rafflesiana Wall. ex. Bak. (Zingiberaceae). Z. Naturforsch. 59c, 811.

Piggot, AG. (1988). Fern of Malaya. Kualalumpur. Malaysia.

Rao AV  & Koratkar R. (1997). Anticarcinogenic Effects of Saponin and Phytosterols. Acs Symposium series 662: Antinutrients and Phytochemicals in Food. Washington DC: University of New Foundland. 313-321.

Smolarz, H.D., Mendyk, E., Bogucka-Kocka, A., Kocki, J. (2006). Pinostrobin-An Anti-Leukemic Flavonoid from Polygonum lapathifolium L. spp. nodosum (Pers) Dans. Z. Naturforsch.  61c. 64-68.

Sukardiman. Pinostrobin dalam Temu Kunci Ampuh Melawan Sel Kanker.  http://www.ariswan.co.cc. Diakses tanggal 9 Nopember 2010.

Suyatno, Indrayanto, G., Zaini, N.C. (2007). Chemical Constituents of the Fern Chingia sakayensis (Zeiller) Holtt. Natural Product Communications. 2 [5] 579-580.