METABOLIT SEKUNDER
DARI TUMBUHAN PAKU Nephrolepis
radicans (Burm.) Kuhn
Suyatno, Rina
Liyaningsih, dan Nisfatul Khasanah
Jurusan
Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya
Jl.
Ketintang Surabaya (60231), Tilp.
031-8298761
e-mail:
suyatno_kimunesa@yahoo.com
ABSTRAK
Penelitian ini ditujukan untuk menentukan struktur molekul senyawa metabolit
sekunder dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans dan menguji
aktivitas pendahuluannya sebagai antioksidan. Dalam penelitian ini ekstraksi
dilakukan dengan metode maserasi, pemisahan dilakukan dengan metode
kromatografi (kromatografi cair vakum), pemurnian dengan metode rekristalisasi, uji kualitatif dengan
pereaksi Liebermann-Burchard, FeCl3 dan Shinoda test, sedangkan penentuan struktur molekul dengan metode
spektroskopi (UV, IR, dan MS). Dari hasil penelitian diperoleh suatu campuran
steroid (kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol) berupa kristal tak berwarna dengan titik leleh 123-125 oC
serta isolat flavonoid pinostrobin (5-hidroksi-7-metoksi flavanon) berupa kristal tak berwarna putih dengan
titik leleh 95-96 oC. Pinostrobin menunjukkan aktivitas antioksidan
berdasarkan hasil uji KLT
autografi menggunakan larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).
Kata-kata kunci: Nephrolepis
radicans, ekstrak n-heksana, flavonoid,
steroid, b-sitosterol,
kampesterol, stigmasterol, pinostrobin, antioksidan
ABSTRACT
The aims of
research are to determine the molecular stucture of the secondary metabolites
isolated from the n-hexane extract of the Nephrolepis
radicans’s stem and to assay
their prior activity as antioxidant. Extraction, separation, and purification
were conducted by maceration,
chromatography (vacuum liquid chromatography), and recrystalization,
respectively. Qualitative tests were carried out using the Liebermann-Burchard reagent, FeCl3,
and Shinoda test, while the molecular
structure of isolates were identified by spectroscopic methods (UV, IR, MS). Based on the reseach, it were
obtained the steroid mixture (campesterol, stigmasterol, and b-sitosterol) as the colorless crystall, m.p. 123-125
oC, and a flavonoid pinostrobin (5-hydroxy-7-methoxy flavanone) as the colorless crystall, m.p. 95-96 oC. Pinostrobin
showed antioxidant activity based on the TLC autography using 1,1-diphenil-2-picrylhydrazyl (DPPH).
Key words: Nephrolepis radicans, n-hexane extract, flavonoid, steroid, b-sitosterol, campesterol, stigmasterol, pinostrobin,
antioxydant
Pendahuluan
Tumbuhan paku Nephrolepis radicans (Burm.) Kuhn merupakan salah satu tumbuhan
paku famili Polypodiaceae serta telah menjadi salah satu kekayaan alam hayati Indonesia
(Piggot, 1988). Tumbuhan paku ini
tumbuh di daerah yang bersuhu sedang (± 25-30 oC), di tempat-tempat
yang kelembabannya tinggi terutama pada musim hujan, sering dijumpai pada tumpukan
batu-bata yang lama tidak digunakan, tanah-tanah yang lembab, di semak belukar,
di tanah yang mengandung limbah, dan di kawasan tepi sungai (Hovenkamp &
Miyamoto, 2005).
Dari beberapa spesies
tumbuhan paku dengan genus Nephrolepis
pernah dilaporkan manfaatnya sebagai bahan obat cacing, kanker perut, serta dapat digunakan sebagai sayuran. Dari
dari tumbuhan paku genus tersebut telah dilaporkan keberadaan senyawa saponin,
kardenolin, flavonoid, dan tanin (Anonim, 2010). Namun demikian pemanfaatan tumbuhan
paku Nephrolepis radicans sebagai
obat tradisional serta kandungan kimiawinya belum pernah dilaporkan.
Dalam makalah ini akan
dilaporkan keberadaan senyawa steroid dan flavonoid dari ekstrak n-heksana
bagian batang tumbuhan paku Neprolepis
radicans serta uji pendahuluannya sebagai antioksidan.
Metode
Alat yang Digunakan
Peralatan yang digunakan meliputi Fisher
John melting point apparatus,
spektrofotometer UV (Shimadzu
Pharmaspec UV-1700), spektrofotometer IR (Buck Scientific-500), spektrometer massa (Shimadzu
QP-5000 menggunakan ion mode EIMS, lampu UV (Desaga Heidelberg), seperangkat
alat kromatografi cair vakum, kromatografi lapis tipis, serta peralatan gelas
yang umum digunakan pada penelitian kimia organik bahan alam.
Bahan yang Digunakan
Bahan yang
digunakan meliputi bahan tanaman yang berupa serbuk kering tumbuhan paku Nephrolepis radicans yang dikumpulkan dari desa Karangtalun, kecamatan
Kalidawir, kabupaten Tulungangung, Jawa Timur dan diidentifikasi di LIPI Kebun
Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur. Bahan kimia yang digunakan berupa n-heksana p.a. dan teknis, kloroform
p.a., etil asetat p.a. dan teknis, metanol p.a, etanol p.a., kieselgel 60 GF-254 (Merck), pelat
silika gel 60 F-254 (Merck), asam klorida p.a., natrium hidroksida p.a.,
aluminium klorida p.a., natrium asetat
p.a., asam borat p.a., larutan FeCl3 5%, dan pita Mg.
.
Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder
Sejumlah serbuk batang (978 g) bagian batang Nephrolepis radicans dimaserasi dengan pelarut n-heksana (4 x 24 jam). Ekstrak n-heksana yang diperoleh diuapkan secara
vakum menggunakan rotavapor menghasilkan ekstrak padat berwarna hijau gelap
(5,27 g). Selanjutnya sebanyak 4,5 g ekstrak dipisahkan dengan cara
kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fasa diam kieselgel Merck 60 GF-254
dan eluen berturut-turut n-heksana,
campuran n-heksana-etil asetat, dan
etil asetat menghasilkan 124 fraksi (@ 15 mL). Hasil pemisahan dimonitor dengan
kromatografi lapis tipis menggunakan eluen n-heksana-etil
asetat = 4 : 1.
Gabungan fraksi 16-28 sebanyak 399 mg direkristalisasi berulang-ulang menggunakan
pelarut metanol menghasilkan isolat A sebanyak 11 mg. Sementara itu fraksi gabungan 34-40 sebanyak 494 mg
direkristalisasi berulang-ulang menggunakan pelarut metanol menghasilkan isolat
B sejumlah 199 mg. Isolat yang diperoleh diuji
kemurniannya dengan menentukan titik leleh dan KLT menggunakan 3 sistem eluen. Identifikasi
struktur molekul dilakukan dengan metode spektroskopi UV, IR, dan MS.
Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan
dengan Uji Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) Autografi
Isolat yang diperoleh diuji potensi pendahuluannya
sebagai antioksidan menggunakan uji KLT autografi. Isolat sebanyak 1 mg
dilarutkan dalam 1 ml pelarut yang cocok, kemudian ditotolkan pada pelat KLT silikagel 60 F-254
menggunakan pipa kapiler. Setelah dikeringkan, pelat disemprot dengan larutan DPPH
0,004% dalam metanol. Hasil uji dinyatakan positif sebagai antioksidan
jika diperoleh bercak kuning berlatar ungu pada
kromatogram (Ervina, dkk., 2002).
Hasil dan Pembahasan
Hasil-Hasil Penelitian
1. Hasil isolasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans
Telah diuraikan sebelumnya bahwa dari hasil pemisahan 4,5 g
ekstrak n-heksana batang tumbuhan
paku Nephrolepis radicans menggunakan
kromatografi cair vakum dihasilkan fraksi sebanyak 124 dengan volume
masing-masing 15 mL.
Berdasarkan hasil monitoring dengan KLT, fraksi 16-28 (399 mg) digabung
dan direkristalisasi menggunakan pelarut
metanol menghasilkan isolat A (11 mg). Isolat tersebut
diperoleh berupa kristal putih kebiruan dengan titik leleh 95-96 oC. Isolat menunjukkan hasil positif dengan FeCl3
(ungu) dan tes Shinoda (Mg-HCl) (kuning). Kromatografi lapis tipis menggunakan
tiga sistem eluen terhadap senyawa hasil isolasi menunjukkan satu noda dengan
harga Rf = 0,75 (n-heksana-etil
asetat = 9 : 1), Rf = 0,83 (n-heksana-etil
asetat = 4 : 1), dan Rf = 0,94 (kloroform) serta satu puncak pada kromatografi
gas pada Rt = 22,4 menit. Dengan demikian isolat telah memiliki tingkat
kemurnian yang tinggi. Spektrum
ultraviolet isolat A dalam pelarut metanol menunjukkan puncak-puncak
serapan pada l maks (log e)
: 289 (7,17), 332 (bh) (6,44) nm;
(MeOH + NaOH): 290 (7,34), 350 (bh) (7,19) nm; (MeOH+AlCl3): 309
(7,26), 372 (bh) (6,54) nm; (MeOH+AlCl3+HCl): 309 (7,23), 375 (bh)
(6,54) nm; (MeOH+NaOAc): 290 (7,44), 339 (bh) (6,33) nm; (MeOH+NaOAc+H3BO3):
292 (7,11), 339 (bh) (6,37) nm. Spektrum IR isolat A yang
dipreparasi dengan teknik pellet KBr memberikan pita-pita serapan pada daerah maks : 3433 (OH), 3040 (C-H
aromatik), 2924 (vibrasi ulur C-H alkil),1645 (C=O terkelasi), 1569 (C=C
aromatik), 1383 (vibrasi tekuk C-H alkil), 1298, 1086 (C-O) cm-1. Spektrum massa isolat A yang diukur dengan teknik EIMS memberikan puncak-puncak pada m/z (int.rel., %): 270 (M+) (93),
242 (5), 227 (6), 223 (1), 193 (100) (puncak dasar),168 (20), 166 (65), 150
(5), 138 (74), 123 (12), 110 (35), 95
(68), 77 (33), 69 (30), 51 (28), 39 (18).
Sementara itu fraksi gabungan 34-40 (494 mg) direkristalisasi menggunakan
pelarut metanol menghasilkan isolat B (199 mg). Isolat tersebut diperoleh
berupa kristal tak berwarna dengan titik leleh 123-125 oC. Isolat menunjukkan hasil positif dengan
pereaksi Liebermann-Burchard (biru). Uji kromatografi lapis tipis menggunakan
tiga sistem eluen terhadap senyawa hasil isolasi menunjukkan satu noda dengan
harga Rf = 0,56 (n-heksana-etil
asetat = 4 : 1), Rf = 0,13 (n-heksana-kloroform
= 1 : 1), dan Rf = 0,38 (kloroform). Namun kromatogram hasil kromatografi gas menunjukkan
3 puncak dengan pada Rt masing-masing 29,3; 29,8 dan 30,6 menit. Dengan
demikian isolat masih belum murni atau merupakan campuran senyawa. Spektrum ultraviolet isolat B dalam pelarut n-heksana menunjukkan puncak serapan utama
pada l maks (log e) = 221 (3,06) nm. Spektrum IR isolat B yang menunjukkan pita-pita
serapan pada daerah maks : 3380 (OH), 2934 dan 2862 (vibrasi ulur
C-H alkil), 1653 (C=C), 1460 dan 1363 (vibrasi tekuk C-H alkil), 1049 (C-O) cm-1. Spektrum massa isolat A yang diukur
dengan teknik EIMS memberikan 3
puncak (B-1, B-2, dan B-3). Spektrum
massa isolat B-1 menunjukkan puncak-puncak pada
m/z (int.rel., %): 400 (M+) (27), 382 (19), 367 (15), 315
(23), 289 (19), 255 (15), 231 (15), 213 (27), 43 (100). Isolat B-2 menunjukkan
puncak-puncak pada m/z (int.rel., %): 412 (M+) (11), 397 (4), 370
(4), 327 (4), 288 (15), 271 (8), 257 (4), 229 (31), 201 (4), 135 (23), 124 (100), 43
(58). Sementara itu isolat B-3 menunjukkan
puncak-puncak pada m/z (int.rel., %): 414 (M+) (76), 396 (23), 381
(19), 329 (73), 273 (15), 255 (23), 231 (19),
213 (31), 43 (100).
2. Hasil uji
aktivitas pendahuluan antioksidan senyawa hasil isolasi.
Berdasarkan hasil uji
pendahuluan aktivitas antioksidan dengan KLT autografi, terbukti bahwa isolat A positif memiliki aktivitas antioksidan, sementara isolat B menunjukkan hasil negatif. Dengan demikian isolat A memiliki
potensi sebagai bahan antioksidan alami.
Pembahasan Hasil Penelitian
1. Penentuan struktur molekul isolat A
Dari ekstrak n-heksana batang tumbuhan
paku Nephrolepis radicans telah
ditemukan suatu senyawa hasil isolasi berupa kristal berwarna putih kebiruan
dengan titik leleh 95-96 oC. Hasil positif
pada uji dengan tes Shinoda (kuning) dan pereaksi FeCl3 (ungu)
menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk golongan flavonoid. Munculnya
dua puncak masing-masing pada lmaks 289 nm (pita II) dan
332 nm (pita I) (bh) dalam spektrum UV mengindikasikan bahwa senyawa hasil
isolasi merupakan senyawa flavonoid jenis flavanon (Markham, 1988). Pita
serapan pada 3433 (OH), 3040 (C-H aromatik), 1645 (C=O terkelasi), 1569 (C=C
aromatik) cm-1 dalam spektrum IR mendukung bahwa senyawa
hasil isolasi termasuk golongan flavonoid. Tidak adanya pergeseran batokromik
pita II pada penambahan pereaksi NaOH dan NaOAc menunjukkan bahwa senyawa hasil
isolasi tidak memiliki gugus OH bebas pada posisi C-7. Pergeseran batokromik
pita II (20 nm) pada penambahan pereaksi AlCl3 + HCl menunjukkan
keberadaan gugus OH bebas pada posisi C-5. Tidak adanya pergeseran batokromik
pita II pada penambahan pereaksi NaOAc + H3BO3
menunjukkan tidak adanya gugus orto-dihidroksi
pada cincin A.
|
Penemuan
flavonoid pinostrobin merupakan yang pertama kalinya dalam tumbuhan paku Nephrolepis radicans serta dalam
tumbuhan paku genus Nephrolepis. Namun
demikian senyawa tersebut telah banyak ditemukan pada divisi tumbuhan berbiji
(spermatophyta), misalnya Boensenbergia
rotunda (kencur), Eucalyptus sieberi
(Birck, et al., 1972), Alpinia rafflesiana (Mohamad, et al., 2004), dan Pinus armandii
(Fang, et al., 1989).
2. Penentuan struktur molekul isolat B
Selain
isolat A, dari ekstrak n-heksana
batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans
juga telah berhasil diisolasi isolat B berupa kristal tak berwarna dengan titik
leleh 123-125 oC. Hasil positif (warna biru) pada uji dengan pereaksi Liebermann-Burchard menunjukkan
bahwa senyawa hasil isolasi termasuk golongan steroid. Puncak serapan pada lmaks 221 nm dihasilkan oleh transisi elektron p ® p* dalam ikatan rangkap dua C=C yang tidak
terkonjugasi. Pita serapan yang tajam dari vibrasi ulur C-H alkil pada 2934 cm-1
dan 2862 cm-1 dalam spektrum IR, memperkuat keberadaan kerangka
hidrokarbon steroid dalam isolat B. Keberadaan gugus OH yang ditunjukkan pita
serapan IR pada 3380 cm-1 mengindikasikan isolat B merupakan steroid
alkohol (sterol). Hal tersebut diperkuat dengan hasil positif dalam uji
Liebermann-Burchard (biru). Berdasarkan analisis dengan kromatografi
gas-spektroskopi massa (GCMS), isolat B ternyata bukan merupakan senyawa
tunggal, melainkan campuran dari 3 senyawa yang masing-masing memiliki massa
molekul relatif 400 (B-1), 412 (B-2), dan 414 (B-3). Berdasarkan perbandingan
pola fragmentasi spektrum massa senyawa B-1, B-2, dan B-3 dengan data dalam library GCMS Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Gadjahmada serta data literatur, diduga ketiga senyawa steroid
tersebut masing-masing adalah kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol. Ketiga fitosteroid tersebut sering ditemukan dalam tumbuhan
paku (Suyatno, et al., 2007;
Kurniawati & Suyatno, 2010). Menurut Rao & Koratkar (1997), ketiga
fitosteroid tersebut secara in vivo mampu menurunkan kadar kolesterol
darah (hipokolesteremik), kolesterol LDL dan lemak darah (hipolipidemik),
mengurangi resiko kanker kolon, efektif mengatasi pembesaran prostat
(antiinflamasi), antibakteri, antifungal, antiatherogenik, dan antiulseratif.
|
|||||
3.
Kajian terhadap aktivitas pendahuluan antioksidan senyawa flavonoid hasil
isolasi
Berdasarkan hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan
dengan KLT autografi menunjukkan bahwa isolat pinostrobin memiliki potensi
sebagai bahan antioksidan karena menunjukkan noda berwarna kuning berlatar ungu.
Aktivitas antioksidan tersebut disebabkan oleh keberadaan gugus OH fenolik pada
C-5 yang mudah teroksidasi membentuk quinon jika bereaksi dengan suatu radikal
bebas. Sifat pinostrobin tersebut sangat diperlukan dalam upaya melindungi
lipoprotein dalam membran sel dari kerusakan akibat reaksi oksidasi dengan
radikal bebas. Sifat kepolaran yang tidak terlalu tinggi dari pinostrobin
sangat mendukung aktivitas antiperoksidasi lipid pada membran sel yang bersifat
relatif non polar.
Mengingat bahwa radikal bebas merupakan salah satu
pemicu terbentuknya sel kanker maka aktivitas antiperoksidasi lipid piostrobin
juga mendukung potensi senyawa tersebut sebagai antikanker. Smolarz, et al. (2006) telah melaporkan bahwa
flavonoid pinostrobin menunjukkan aktivitas antikanker terhadap leukemia sel
line HL-60. Larutan 1 mM pinostrobin mampu menyebabkan apoptosis sel sebesar
70-88%. Disamping itu juga dilaporkan oleh Sukardiman bahwa pinostrobin dalam
temu kunci sangat ampuh untuk melawan sel kanker, karena senyawa tersebut
bersifat antioksidan, mampu menyebabkan apoptosis sel kanker, serta menghambat
kerja enzim DNA topoisomerase I (Sukardiman, 2010). Dengan demikian isolat
flavonoid pinostrobin tersebut memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai
bahan antioksidan dan antikanker.
Simpulan
Berdasarkan hasil-hasil penelitian yang telah dibahas pada bagian
sebelumnya dapat disimpulkan bahwa dari batang
tumbuhan paku Nephrolepis radicans telah
berhasil dipisahkan suatu senyawa flavonoid golongan flavanon yaitu 5-hidroksi-7-metoksi flavanon (pinostrobin) serta campuran steroid kampesterol, stigmasterol, dan b-sitosterol. Isolat flavonoid pinostrobin memiliki potensi
untuk dikembangkan sebagai bahan antioksidan.
Ucapan
Terimakasih
Ucapan terimakasih disampaikan kepada
saudara Wardaya dari LIPI Kebun Raya Purwodadi, Pasuruan, Jawa Timur yang telah membantu dalam mengidentifikasi
sampel tumbuhan.
Daftar Pustaka
Anonim. (2009). Tumbuhan paku. http://blogger-bioika.blogspot.com.
Diakses pada tanggal 2
Desember 2010.
Bick, I.R.C., Brown, R.B., Hillis, W.E. (1972). Three
flavanones from leaves of Eucalyptus sieberi. Aust. J. Chem. 25. 449-451.
Ervina, M, Soediro, I.S., Kusmardiyani, S. (2002). Akar
lobak (Raphanus sativus L. var Hotensis back.) sebagai Penangkap Radikal
Bebas. Jurnal Obat Bahan Alam. 1 [1] 7-15.
Hovenkamp, P. H. &
Miyamoto, F. (2005). A Conspectus of the Native and
Naturalized Species of Nephrolepis (Nephrolepidaceae) in the
World. Blumea. 50. 279-322.
Kurniawati I &
Suyatno. (2010). Senyawa Steroid dari Ekstrak Etil Asetat Daun Tumbuhan Paku Angiopteris evecta (G.Forst) Hoffm. Prosiding Seminar Nasional Kimia.
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya. Tanggal 20 Pebruari 2010.
Markham, K.R.
(1988). Cara
Mengidentifikasi Flavonoid. Penerjemah
Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB.
Mohamad, H., Abas, F., Permana, D., Lajis, N.H.,
Alib, A.M., Sukaric, M.A., Hinc, T.Y.Y., Kikuzakid, H., Nakatani, N. (2004). DPPH Free
Radical Scavenger Components from the Fruits of Alpinia rafflesiana Wall.
ex. Bak. (Zingiberaceae). Z. Naturforsch. 59c, 811.
Piggot, AG. (1988). Fern of Malaya. Kualalumpur. Malaysia.
Rao
AV & Koratkar R. (1997). Anticarcinogenic
Effects of Saponin and Phytosterols. Acs
Symposium series 662: Antinutrients and Phytochemicals in Food. Washington DC:
University of New Foundland. 313-321.
Smolarz, H.D., Mendyk, E., Bogucka-Kocka, A., Kocki,
J. (2006). Pinostrobin-An Anti-Leukemic Flavonoid from Polygonum lapathifolium L.
spp. nodosum (Pers) Dans. Z. Naturforsch. 61c. 64-68.
Sukardiman. Pinostrobin dalam Temu Kunci Ampuh
Melawan Sel Kanker. http://www.ariswan.co.cc. Diakses tanggal
9 Nopember 2010.
Suyatno, Indrayanto, G., Zaini, N.C.
(2007). Chemical Constituents of the Fern Chingia
sakayensis (Zeiller) Holtt. Natural
Product Communications. 2 [5] 579-580.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar